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作者:安德鲁便士。Karalewitz博士。
日期:2021年3月
免疫疗法代表了最先进的癌症治疗。通过利用精美的特异性的免疫系统,现代免疫疗法可以针对一种癌细胞,同时避免健康组织。Kymriah™来自诺华和Yescarta™由风筝/基列是fda批准的细胞免疫疗法治疗急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。
生产Kymriah™或Yescarta™,病人的T细胞设计表达Chimeric一个ntigenReceptors(汽车)特定的CD19 B淋巴细胞分子(1)。最近的临床成功anti-CD19汽车T细胞疗法对血液癌症,下一代汽车增强活动和安全设计。
Labcorp临金博宝188网址床肿瘤学(PCO)提供Chimeric一个ntigenReceptor(汽车)T细胞生成。这个服务地址越来越需要可靠的汽车T细胞来源用于早期发现研究。赞助商可以使用预制anti-CD19汽车T细胞,或客户可能提供慢病毒颗粒来表达他们选择使用定制的汽车车T细胞生成服务。金博宝188网址临床前评价多个汽车候选人将允许赞助商来识别最活跃的汽车通过药物研发进展管道。这辆车T细胞生成服务构建在经验生成luciferase-expressing细胞系,并与内部补充专业知识处理和培养T细胞和T细胞。足够数量的汽车早期发现研究T细胞与汽车生产T细胞生成服务。
汽车T细胞一代工作流是由三个不同的技术阶段:汽车T细胞生成,流式细胞术评估汽车表情,和一个在体外杀死化验测试车T细胞活动。的在体外杀死试验可能被用来作为一个独立的服务如果赞助商已经车T细胞的来源和感兴趣的测试车T细胞功能使用可用的许多癌症细胞系的客户之一。在这个模型中关注的焦点,车子T细胞生成服务演示了使用一个anti-CD19汽车作为一个例子。
慢病毒转导Anti-CD19汽车T细胞生成
汽车是理性设计的蛋白质组成的一个细胞外的抗原受体胞内信号域。抗原受体通常基于单链可变片段(ScFv)单克隆抗体(mAb)。胞内信号域包括T特异性activity-modulators如4-1-BB和TCR-ζ细胞质信号链(CD3ζ)(图1)(1)生成anti-CD19汽车T细胞,慢病毒表达系统是用来传递遗传物质编码汽车构造成T细胞。人类外周血单核细胞(hPBMCs)健康的捐赠者与慢病毒转导,随后扩大在文化、和低温贮藏,以供将来使用。与病毒,T细胞转导或untransduced T细胞(UTD),增殖实现的可行性post-transduction大于90%(图1 b和c)。
图1——Anti-CD19汽车T细胞合成。(一)示意图描述anti-CD19汽车功能域的组织。Anti-CD19单链可变片段(ScFv)细胞外,基于FMC63马伯antigen-binding域。CD8铰链和跨膜域胞外和胞内域的链接。细胞内,信号部分anti-CD19汽车来自4-1-BB CD3ζ。(B)住T细胞数确定和吖啶橙Propidium碘(AO / PI)。(C) T细胞生存能力决定与AO /π。增长曲线和日常生存能力测量是两个独立的转导的代表。
评估Anti-CD19汽车表面表达
功能分析anti-CD19汽车T细胞是必要的,以确定如果慢病毒转导是成功的。流式细胞仪是用来量化汽车+ T细胞的数量,确定转导效率。表面的表达anti-CD19车是衡量使用马伯,特别结合FMC63 ScFv(图2)。浇注后排除紧身衣和碎片,活细胞识别,和汽车表达式决定。Untransduced (UTD) T细胞CD3 + 96%和0.14% CD3 + / +(图2 b)。用慢病毒治疗T细胞后,大约有25%的T细胞CD3 + / +(图2)。double-positive T细胞的百分比的增加,CD3 + / +,表示转导是成功的。曼联和anti-CD19汽车T细胞均大于90%可行的基于可行性染料排斥。
图2——评估anti-CD19汽车表面通过流式细胞术表达式。(一)图描绘流式细胞术染色确定积极的转化株。Untransduced T细胞(UTD)不表达anti-CD19车,不会受anti-ScFv马伯(左)。慢病毒转导后病毒(+),一个anti-ScFv马伯将结合T细胞表达anti-CD19汽车(右)。流式细胞术(B)代表的情节。活细胞识别基于可行性染料排斥。曼联T细胞96%可行和单个人类CD3阳性(hCD3 + / anti-CAR)(象限1,Q1) (98.3%)。曼联T细胞不表达anti-CD19汽车(hCD3 + / anti-CAR +)(象限2,Q2) (0.14%)。流式细胞术(C)代表的情节。Anti-CD19汽车T细胞96.5%可行和表达Anti-CD19汽车(hCD3 + / anti-CAR +)(象限2)(25.1%)。 SSC = side scatter.
评估Anti-CD19汽车T细胞的功能
以确定anti-CD19汽车T细胞功能,目标细胞杀死进行了分析(图3)。简而言之,目标细胞是曼联培养或anti-CD19汽车T细胞。第二天,靶细胞生存能力由流式细胞仪测量。Anti-CD19汽车T细胞应该专门杀死靶细胞表达CD19虽然没有影响靶细胞没有CD19表达式。流式细胞术评估CD19细胞表面表达的目标(图3 b)。NALM6细胞表达CD19 MV-4-11细胞没有(图3 b)。
图3——汽车T细胞细胞毒性试验设计和目标细胞特征。(一)流程图概述细胞毒性实验的主要步骤。NALM6,急性淋巴细胞白血病细胞。消极的控制,biphenotypic B-myelomonocytic白血病,MV-4-11细胞。T细胞和靶细胞输入计算使用自动细胞计数和AO /π。(B)流式细胞术评估CD19在靶细胞表面表达。直方图显示MV-4-11和NALM6 CD19表达水平没有(-)和anti-CD19马伯的(+)。NALM6细胞表达CD19 MV-4-11细胞不表达CD19。
Anti-CD19汽车T细胞细胞毒性对NALM6细胞吗(图4)。CD19 + NALM6细胞的数量和CD3 + T细胞识别。浇注后总CD19 +细胞,死CD19 +细胞的比例确定。活细胞CD19 + /可行性染色阴性。靶细胞单独培养~ 96%是可行的。反向盖茨表明死靶细胞的百分比(3.7%)(图1)。更大比例的死亡NALM6细胞中观察到井anti-CD19汽车相对于NALM6 T细胞细胞孵化UTD T细胞(图4 a、B和C)。向MV-4-11细胞毒性细胞百分比等于对曼联和anti-CD19汽车T细胞(图4 d)。结果表明anti-CD19汽车T细胞是专门主动向CD19-expressing靶细胞并验证成功的汽车T细胞生成服务
图4——评估anti-CD19汽车T细胞的功能。流式细胞术(A)代表情节与untransduced NALM6杀死试验进行了T细胞。总目标细胞进行了分析可行性染料吸收。死靶细胞门数字代表细胞活细胞外门的百分比。前只负控制靶细胞样本(0:1,T细胞:靶细胞比率)。底是3:1的结果,T细胞对靶细胞的比例。流式细胞术(B)代表情节NALM6杀人anti-CD19汽车进行分析T细胞。总目标细胞进行了分析可行性染料吸收在a (C) NALM6细胞毒性试验的结果。一系列稀释总T细胞与NALM6细胞孵化。分析了A和b,每个数据点和误差代表一式三份的平均值和标准差培养。 (D) Results of MV-4-11 cytotoxicity assay. Assay was conducted and analyzed as with NALM6 cells except MV-4-11 target cells were identified by staining for a non-CD19 surface protein. Representative flow cytometry plots not shown. Cytotoxicity assay results are representative of two independent experimental replicates.
总结
从健康开始,人类PBMCs Labcorp汽车T代服务生产的汽车+ T细胞在足够的数量在体外和在活的有机体内鉴定。汽车生产T细胞生成的最终可交付服务这里描述CD3 + > 95%, > 90%可行,特别对CD19-expressing人类淋巴母细胞性白血病细胞的细胞毒性。T细胞转导协议是基于技术和建立适合替代汽车构造,允许Labcorp提供一个定制的汽车T代服务我们的客户(2)。汽车产生T细胞用于临床前研究将推进我们客户的早期的发现程序使用组合或小说汽车T疗法。金博宝188网址
引用
1)6月CH,奥康纳RS Kawalekar OU, Ghassemi年代,Milone MC。汽车T细胞免疫治疗人类癌症。科学。2014;359 (6382):1361 - 1365
叶RK, 2) Quintas-Cardama, Hollyman D, Stefanski J,泰勒C, Nikhamin Y, Imperato G, Sadelain M河我Brentjens RJ。多因子的优化gammaretroviral基因转移到人类T淋巴细胞的临床应用。嗡嗡声其他基因。2007;18日(12):1253 - 60
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