测量人体细胞因子在小鼠样本发现设置:理解免疫测定技术和管理风险

介绍

小鼠模型中常用的各种癌症相关的调查,他们主机人类细胞(1),(免疫功能不全的)小鼠模型有其利弊,鼠标仍然是一个普遍使用在临床肿瘤学测试系统。金博宝188网址

在蛋白质水平,人类和老鼠相似,有时几乎相同,氨基酸序列(表1)。当人类肿瘤和淋巴细胞用于immuno-oncology或嵌合抗原受体(汽车T) T细胞免疫功能不全的研究老鼠,一系列的方法可以用来评估其功能和肿瘤回归。这里我们讨论与分析相关的技术方面在考虑人类蛋白质样本的测量来自一只老鼠。理解免疫测定技术是至关重要的解释数据时从这个不同寻常的场景。

ELISA

在临床前阶段,金博宝188网址大多数实验室从可信的商业供应商购买免疫测定方法量化水平血清或血浆中蛋白质的兴趣。合同研究组织(cro)需使用商业有很大的经验的分析,可以帮助决策过程在最合适的方法来使用和哪家公司购买。这些商业采购方法通常夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。在临床前药物开金博宝188网址发的探索阶段,良好的实验室实践(GLP)不需要免疫测定方法的验证,但质量数据当然是必需的。免疫测定的GLP验证支持药物的安全性评价候选人将会在之后的药物发现和开发过程。

抗体的ELISA方法使用被动吸附一个塑料表面(通常是一个96孔板)来捕获感兴趣的靶蛋白。与缓冲洗后样品补充道。短潜伏期后,样品被冲走,另一种抗体(检测的抗体)补充道。检测抗体捕获的靶蛋白结合,形成“三明治”(图1)。检测抗体通常是标记一种酶,这种酶会改变基板的颜色,或与一个分子发光。信号(光密度或光能量)正比于样品中蛋白质含量。可以找到更详细的免疫测定技术在众多评论(2 - 4)。

默沙东公司平台

内消旋规模发现(MSD)平台是一个通用的免疫分析平台。默沙东公司市场的化验三明治免疫测定(ELISA),通过电化学发光发光能量(ECL)。默沙东提供数以百计的免疫分析试剂盒包括无数的多路复用选项为人类,老鼠和老鼠蛋白质所常用的横,制药和生物技术公司,一些学术机构。默沙东是免疫原性测定的首选平台(也称为禁毒抗体(ADA)化验),通常用于定制的药代动力学(PK)化验来衡量生物药物的浓度。ADA和PK分析建立在MSD平台经常通过严酷的GLP验证。

默沙东公司平台允许“复用”。多路复用是一种技术,允许多个分析物测定的数量在一个。多路复用节省时间,减少板的数量需要处理并保存在相同样本数量自50微升样本可以分析十个不同的方式。多路复用是非常宝贵的评估毒性时,确定行动的机制(农业部),或生物标志物发现化验(5)。

矩阵

生物液体添加到井ELISA板的矩阵。矩阵通常是血清或血浆中但也可以组织文化媒体,玻璃体(从眼内液),滑液(关节)、尿液、眼泪、汗水甚至细胞溶菌作用缓冲区用来释放胞内蛋白。一个矩阵是一个复杂的流体和能引起许多问题ELISA测定。总的来说,这些问题通常称为“基体效应”。基质效应是由干扰引起的内源性组件,包括白蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、补体C4,载脂蛋白结合珠蛋白,不同丰度和物种之间的氨基酸序列。基体效应通常进行稀释,dilutional线性或峰值和恢复实验(6)。验证了生产通常会声称他们的免疫测定血清和/或等离子体但不是所有可能的矩阵。商用分析很少验证为人类和小鼠的血清和血浆。使用一种免疫测定目的以外的其他目的,由制造商是一个可识别的风险。一些制造商把免责声明在其文学作品中说明使用矩阵以外他们不支持进行验证。理解风险是很重要的,特别是当使用商业对人类蛋白质定量分析从一只老鼠矩阵。

免疫原

分析使用的抗体作为工具来捕获和检测蛋白质的兴趣(图1)。免疫原注入动物引起免疫反应。使用抗体来源于动物注射免疫原免疫测定的关键材料。产生的抗体试剂用于免疫测定蛋白质的目标发展,蛋白质是免疫原。不同大小的蛋白质免疫原,可以使用从各种各样的来源。常用的重组蛋白,纯化内源性蛋白质使用频率更低。laboratory-synthesized小肽(8-20氨基酸),或略大肽(20 - 100个氨基酸),经常使用,因为易于合成的多肽和已知的和相对较短的氨基酸序列与完整的蛋白质。免疫原的氨基酸序列信息是非常重要的,因为潜在的物种之间同源性。大量的网络资源包含老鼠和人类蛋白质氨基酸序列信息可以在表2。获得免疫原的信息用于生成抗体产品中发现的商业购买ELISA测定是非常困难的。抗体和酶联免疫试剂盒供应商常常声称具体信息用于免疫动物的氨基酸序列是一个“商业秘密”或“机密”。 A common entity in the antibody and ELISA kit business is the ‘OEM’ (Original Equipment Manufacturer) that many people associate with the automotive parts business. Many, but not all, companies that sell ELISA kits or antibodies do not actually make the kit or antibody themselves (7). They purchase the antibody or ELISA from someone else and then market it under their own branding. This creates issues for the consumer, including the availability of technical support assistance, information on timelines regarding when the product will ship, and price.

交叉反应性

抗体作为捕获或检测试剂在分析一般只绑定到一个蛋白质,感兴趣的分析物。有时,一个免疫测定可以检测多个蛋白质。这就是所谓的交叉反应性。测量人类细胞因子在小鼠矩阵的情况是很不寻常。交叉反应性物种就是一个免疫分析法检测蛋白质相同器官从两个或更多的物种。仔细考虑的氨基酸序列同源性分析物之间的人类和小鼠需要管理潜在的交叉反应性物种。免疫原用于生成的氨基酸序列捕获和检测抗体是至关重要的信息;使用商业购买化验时,供应商一般不会透露这些信息。

测试物种交叉反应性

评估个体分析的可能性在人类多路检测小鼠细胞因子,我们生成的样品在体外对干扰素ℽ老鼠高水平的细胞因子,il - 10, 2、il - 6和TNF-α和样品适用于人类的多路复用。低温贮藏小鼠脾细胞解冻到完全培养基(RPMI 1640, 10%的边后卫,1 x GlutaMAX, 10毫米玫瑰,1毫米丙酮酸钠,和1 x非必需氨基酸)。活细胞数通过绝对指望CytoFLEX LS流式细胞仪平台。细胞被播种到6-well板的密度1 x10⁶细胞的体积/毫升10毫升/。板是在37℃培养,5%的公司₂湿润孵化器为5个小时。一夜之间,脾细胞被刺激的50 ng / mL佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)和500 ng / mL ionomycin。如果从相同的脾细胞孵化并行作为消极的控制。最后一夜之间文化时期,媒体是收获,细胞被离心(300 rcf 8分钟),和上层的冷冻和储存在-80℃。分析了小鼠脾细胞分泌的细胞因子在V-PLEX促炎面板1鼠标(目录K15048D-1),结果如表3所示。随后分析了小鼠脾细胞分泌的细胞因子在V-PLEX促炎面板1人(目录K15049D-1)和结果如表4所示。可评价的细胞因子(il - 10,干扰素ℽ- 2、il - 6和TNF-α)没有交叉反应性物种。

总结

测量人类细胞因子从鼠标样品从分析的角度来看是一个不寻常的情况。理解潜在干扰的技术方面是重要的解释数据时产生一个免疫测定用于范围以外的制造商的意图。交叉反应性物种似乎没有一个问题可评价的细胞因子(il - 10,干扰素ℽ- 2、il - 6和TNF-α)检测在MSD V-PLEX促炎的面板。仔细评估可用的信息后,测定似乎适合使用。更详细的讨论在人类细胞因子水平的评价人类免疫细胞从老鼠主机,请联系我们使用下面的链接。

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图1所示。夹心ELISA。小鼠单克隆抗体(蓝色),被动地绑定到的96孔板,捕获蛋白质分析物(靶蛋白)。sulfo-tag(黄色恒星)共轭兔多克隆抗体(红色)捕获的被分析物结合,形成了一个“三明治”。sulfo-tag和基质之间的相互作用会导致光测量的相机在MSD仪器。生成的光量成正比的分析物。

表2。蛋白质和氨基酸序列信息,选择基于web的参考资料(8)。

表3。小鼠脾细胞在细胞培养对待PMA(佛波醇醋酸12-myristate 13)和ionomycin细胞培养媒体分析鼠标在MSD V-PLEX促炎性细胞因子面板1鼠标套件。值在pg / mL。

* BLD:检测极限以下

引用

1。布尔特CJ, Krupke DM,贝格利哒,et al。老鼠肿瘤生物学(MTB):人类癌症的小鼠模型的数据库。核酸研究》2015年1月,43(数据库问题):D818-24。

2。施瓦兹可免疫测定的酶-概述。中国。1983;16(1):4 - 9日。

3所示。一位美国短暂的历史、原则和类型的ELISA,和我们实验室的经验使用ELISA肽/蛋白分析。肽。2015;72:4-15。

4所示。Porstmann T和圣黄铁矿。酶免疫测定技术。概述。J Immunol方法。1992;150(1 - 2):5 - 21日。

5。贾尼D, Allinson J,贝里沙F, et al。建议使用和定制验证生物标志物的多功能配体结合化验在药物开发。aap j . 2016; 18 (1): 1 - 14。

6。班纳特涂J, P。并行性实验来评估基体效应,在配体结合试验方法开发选择性和灵敏度:优点和缺点。生物分析法。2017;9(14):1107 - 22所示。

7所示。卡梅隆乔丹。抗体供应商的商业行为会如何影响你的配体结合试验。生物分析法。2014;6 (12):1585 - 9。

8。考恩KJ, Amaravadi L,卡梅隆MJ,等。建议选择和鉴定蛋白质的生物标志物测定校准器材料。aap j . 2017; 19 (6): 1550 - 63。