生物发光成像:在体内监测肿瘤发展、疾病传播和治疗效果

生物发光成像(BLI)是一种非侵入性光学成像方式，旨在可视化和量化组织中的生物发光信号。¹BLI是基于检测在酶被表达时酶介导的底物氧化过程中产生的可见光在薇芙O作为分子报告者。

与使用终端终点、侵入性程序或放射标记的传统成像和生物分布研究相比，BLI提供了一种健壮、灵敏和高通量的替代方法。2003年，我们是第一个提供BLI的CRO, 17年来，我们在光学成像领域积累了相当多的经验和技术。在本次技术重点报道中，我们将介绍生物发光成像的原理，并强调这种临床前服务在癌症检测、监测疾病进展和治疗方面的优势金博宝188网址在活的有机体内抗肿瘤疗效评估。

BLI需要细胞表达荧光素酶，这个词来自拉丁语路西法-光使者，由萤火虫或海三色堇产生。萤火虫卢克基因首次克隆于1985年²而且，绿色是最常用的荧光彩色成像。萤火虫荧光素酶需要注入它的底物d -荧光素，它产生一个峰值在562纳米的生物发光信号，被放置在一个光密柜中的高量子效率带电耦合器件相机(CCD)捕获。从工程肿瘤细胞表达荧光素酶到成像动物的一系列事件在活的有机体内如图1所示。我们使用IVIS®In Vivo成像系统(PerkinElmer, Waltham, MA)，该系统具有高灵敏度和高分辨率在活的有机体内BLI和荧光成像(FLI)跨越宽波长范围。在2%的异氟醚气体麻醉下，动物每次可成像5个。每只小鼠注射d -萤光素10-15分钟后成像。BLI信号在肿瘤周围绘制的感兴趣区域(roi)、特定区域(例如头部、胸部或腹部)、全身或组织进行量化体外信号用每秒的光子表示，表示从用户定义的区域全方位辐射的通量。图像分析使用live Image 4.3.1 (PerkinElmer, Waltham, MA)软件。

图1:使用发光活细胞的活体生物发光成像。携带启动子驱动的luc基因的载体转染到肿瘤细胞中。稳定转染的细胞被扩展并植入老鼠体内。肿瘤生长后，动物被注射荧光素，并在麻醉下在IVIS成像系统中成像。lucc细胞发出光，可以在时空上被追踪。

监测原位实体瘤生长

在过去的20年里，BLI方法和工具的有效性和敏感性导致了越来越广泛的应用目录:蛋白质-蛋白质相互作用的研究，遗传筛选，细胞周期调节剂，寄生虫感染，干细胞移植跟踪，NK细胞迁移，尤其是临床前肿瘤学。金博宝188网址大量的研究表明BLI成像能够评估肿瘤的发展。^3.当肿瘤生长不能通过卡钳测量而依赖于临床体征如体重减轻或动物安乐死后肿瘤负担评估时，这一点尤为重要。在下面所示的例子中，动物护理和使用是在经过IACUC协议审查和批准的aaalac认证设施中根据动物福利法规进行的。

图2显示了非侵入性BLI在监测深部组织肿瘤发展中的价值。NCI-H460-Luc2人肺癌异种移植体原位植入(OT) (1x10⁵雌性裸鼠左肺细胞/小鼠)。BLI(图2，左上)显示，早在肿瘤细胞植入后8天就可检测到胸腔内的肿瘤(由于阈值在第28天达到最大信号，在图像中无法看到)，在接下来的2周内肿瘤负担增加。在整个研究期间，小鼠的平均体重下降了18.3%，可能与疾病相关(未显示)，并在肿瘤细胞植入后28天被安乐死。尸检显示原发肿瘤明显生长，并在整个胸腔内形成大量肿块。在图2左下，雌性白化C57BL/6小鼠被植入了GL261-luc2同基因小鼠胶质瘤细胞(1x10⁶细胞/鼠标)。植入后7天可在大脑中检测到肿瘤。在该模型中，与疾病进展相关的体重下降是常见的，在肿瘤植入后11天可检测到，而中位死亡时间约为21天。人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-231-luc-D3H2LN在心内注射后形成骨病变(1x10⁵细胞/小鼠)。在注射肿瘤细胞21天后，骨病变清晰可见，在接下来的3周内，肿瘤数量和肿瘤总负荷均有所增加(图2，右侧，顶部和底部)。到第32天，小鼠的体重最大减轻了16.2%。体重减轻很大程度上与模型的攻击性有关(未显示)。从这些研究中得到的信息是，BLI可以成为一种强大的工具，用于实时、无创地调查各种类型的肿瘤，而不单纯依赖疾病的临床体征，这些体征可能伴随着肿瘤负担的增加，也可能不伴随着肿瘤负担的增加。

图2:几个活体模型的代表性BLI图像。左上，NCI-H460-Luc2人肺癌植入的OT(左肺)雌性裸鼠。左下为雌性白化病C57BL/6小鼠植入OT(大脑)的同基因小鼠胶质瘤GL261-luc2细胞，右下为裸鼠心内注射后的人乳腺肿瘤MDA-MB-231-luc-D3H2LN骨病变，显示俯卧位(上)和仰卧位(下)的全身图像。

成像血液恶性肿瘤

我们拥有超过80种独特的血液恶性肿瘤细胞系，在与市场相关的血液恶性肿瘤模型行业中处于领先地位，特别是过继细胞治疗(ACT)，也被称为细胞免疫治疗领域。⁴BLI在评估血液系统播散性恶性肿瘤的进展和治疗反应时具有重要价值。将4种不同的人类血液癌细胞注射到NSG小鼠中进行的纵向研究显示，在所有模型中，肿瘤负担随着时间的推移而增加(图3)，强调了BLI在反复评估疾病进展和严重程度以及了解肿瘤信号在全身的生物分布方面的价值。

图3:在NSG小鼠静脉注射后，几个活体人血液恶性肿瘤的代表性BLI数据。

ACT不断发展，为患者提供更好、更个性化的选择。CAR-T细胞是一种自体或异体T细胞，专门靶向肿瘤细胞表达的抗原或标记物。金博宝188网址临床前在活的有机体内在将这些新疗法应用于临床之前，对CAR-T细胞的有效性和安全性的评估是至关重要的。图4所示的研究旨在测试不同CAR-T制剂和剂量的人Raji-luc B细胞淋巴瘤细胞植入NSG小鼠。3种不同的CAR-T结构显著抑制了肿瘤负担并延长了生存期，突出了BLI为这些新的细胞免疫疗法的发展带来的价值。

图4:CAR-T治疗人Raji-luc B细胞淋巴瘤IV植入NSG小鼠的效果。上图:肿瘤细胞接种和CAR-T治疗示意图。下:BLI评估的肿瘤负荷和总生存率。

监测治疗效果

辐射

显然，BLI的主要优势之一是能够在同一只动物身上跟踪抗肿瘤治疗的疗效，从而减少了使用的动物数量。在图5所示的例子中，雌性裸鼠颅内植入NCI-H1975-luc人非小细胞肺癌，以模拟肺转移到大脑。小鼠接受两个疗程的分级辐射(2Gy;5天工作，2天休息，2个周期)，由RadSource RS-2000辐照器提供。对照组采用假照射。随着时间的推移，BLI图像的获取表明，放疗显著降低了肿瘤负担(图5，第19天p<0.05)，延长了160%的寿命(p<0.05，未显示)。在这个实验中，我们能够量化治疗反应在活的有机体内这在监测疗效以及设计和改进新的治疗方法时至关重要。

图5:局部放疗的效果(2Gy;连续5天，休息2天，共2个周期)对女性裸鼠颅内植入的NCI-H1975-luc人非小细胞肺癌的抑制作用。

检查点抑制和联合治疗

检查点抑制(单独或联合放疗)的效果在小鼠同基因GL261-luc2胶质瘤细胞内植入雌性白化病C57BL/6小鼠中进行了测试。小动物辐射研究平台(SARRP;单剂量7.5Gy的抗小鼠PD-1(克隆RMP1-14, 10 mg/kg)或两种疗法的联合。如图6(左)所示，在肿瘤细胞植入后6天，BLI信号已经可检测到，并在接下来的几周内持续恶化。对产生的生物发光信号的量化(右)显示了治疗对肿瘤负荷的影响。抗mpd -1治疗导致2.6天的肿瘤生长延迟和1/8的无肿瘤存活(TFS)，而放疗导致16.6天的肿瘤生长延迟和2/8的TFS。联合放疗和抗mpd -1治疗在7/8只小鼠中导致了显著的38.6天的肿瘤生长延迟和完全缓解。传统的测量体内深层恶性肿瘤抗肿瘤反应的方法是基于终末的，而且往往耗时。如这些例子所示，积分在活的有机体内BLI成像使我们从肿瘤治疗的“黑匣子”转变为对个体反应的实时评估，提供了更快速调整和改进治疗的灵活性。

图6:局灶辐射、抗mpd -1和联合治疗对雌性C57BL/6白化小鼠颅内GL261-luc肿瘤的影响。

多峰性

BLI可以与其他成像模式相结合，以询问不同的生物通路。为了说明这个应用程序，我们使用了同基因4T1-luc2-1A4小鼠乳腺腺癌细胞注射OT到免疫能力BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到~300 mm时^3.ProSense是一种近红外显像剂^TM静脉注射750以检测与侵袭性乳腺癌生长相关的组织蛋白酶活性。ProSense^TM750是一种光学静默剂，在与组织蛋白酶裂解时产生荧光。如图7所示，BLI和FLI肿瘤信号在肿瘤中很容易检测到。然而，BLI和FLI信号并不是完全重叠的，这是意料之中的，因为荧光素酶是由所有活的肿瘤细胞产生的，而荧光信号不仅局限于肿瘤细胞，还局限于其他肿瘤相关细胞，主要是负责组织蛋白酶ProSense的切割和摄取的巨噬细胞^TM750年的调查。因此，多模态可以用来询问不同的生物学在活的有机体内同时,。

图7:静脉注射组织蛋白酶特异性ProSenseTM750荧光探针24小时后，BLI(左)和FLI(右)对4T1-luc2-1A4肿瘤的多模态成像。下面是相应肿瘤的特写。

总结

深组织癌症和癌症转移的小鼠模型主要依赖于晚期评估，如组织重量、结节计数和/或肿瘤负荷的组织学分析。自20多年前引入以来，BLI已成为一种宝贵的技术，可以跟踪生物荧光标记癌细胞系随时间的增长动态，并对各种治疗方法作出反应在活的有机体内这样可以减少研究动物的数量，因为可以随着时间的推移对相同的对象进行成像，而不需要进行最后的评估。BLI在多个科学领域做出了重大贡献，除了提供了一种替代使用已建立的有创或放射性同位素依赖的无创成像模式。

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参考文献

¹Contag CH, Spilman SD, Contag PR, Oshiro M, Eames B, Dennery P, Stevenson DK, Benaron DA。利用生物发光报告器可视化活的哺乳动物的基因表达。Photochem Photobiol 1997;66: 523 - 531。

²de Wet JR, Wood KV, Helinski DR, DeLuca M.萤火虫荧光素酶cDNA的克隆及荧光素酶活性的表达大肠杆菌．Proc。国家的。学会科学。美国1985年;82年,7870 - 7873。

^3.詹金斯·德，黄志勇，霍尼格·YS，余sf, Dusich J, purcheo T, Contag PR.生物发光成像(BLI)改进和改进传统小鼠肿瘤生长和转移模型。临床经验转移，2003;20(8): 733 - 744。

⁴https://www.cancerresearch.org/immunotherapy/treatment-types/adoptive-cell-therapy