流式细胞仪绝对计数-最大限度地提高您的免疫表型数据解释的准确性

在本次科技聚焦中，我们将介绍绝对计数的原理，以及这项服务与肿瘤免疫表型分析结合使用时所提供的优势。

绝对计数是流式细胞术科学家量化组织内细胞总数的一种应用，可用于测量免疫细胞对肿瘤的浸润情况。在本次科技聚焦中，我们将介绍绝对计数的原理，以及这项服务与肿瘤免疫表型分析结合使用时所提供的优势。

在测试新的免疫调节疗法时，准确测量肿瘤微环境(TME)内免疫反应的动态变化的能力是至关重要的。虽然稳健免疫分型组的配置对于精确描述子集是必要的，但报告这些终点的方法可能会影响数据最终的解释方式。一个常见的读数是“% CD45”⁺细胞，”它测量每个子集的相对分布作为总免疫细胞的百分比。^1、2这种方法很有价值，因为它有助于量化治疗对具有不同亲肿瘤和抗肿瘤活性的亚群比例的影响。例如，CD8比例的增加⁺T细胞和相应的调节性T细胞减少表明治疗减少了TME中的调节性T细胞介导的免疫抑制。

然而，使用分布测量作为唯一的读数有局限性。下面的示例演示了这一点。在本研究中，CT26荷瘤小鼠使用抗mctla -4检查点抑制剂治疗，结果显著抑制肿瘤生长(图1)。为了研究其作用机制，我们首先使用流式细胞术来分析肿瘤来源的CD3分布⁺和CD11b⁺细胞(T细胞和髓系细胞)中的CD45⁺(见图2)。解释器可能从这些数据中得出结论，CTLA-4阻断引发了T细胞数量的增加和髓细胞数量的同时减少。这表明治疗的机制活性是由抗肿瘤CD8数量的增加介导的⁺T细胞以及免疫抑制骨髓细胞的收缩。正如你将在下面看到的，这个结论是不正确的。

图1:CT26细胞皮下植入Balb/c小鼠右腋窝。当肿瘤建立时开始给药n=10只动物/组，并通过卡尺测量监测肿瘤进展。在第14天采样前，每周两次给予抗体剂量。

为了克服上述限制，通常使用绝对计数的串联计算。该终点通过免疫亚群准确测量肿瘤的浸润，通常报告为每单位质量的总细胞数。^3、4、5当将绝对计数添加到上述研究中时，很明显，实际上抗mctla -4治疗后，每克肿瘤的总髓细胞计数并没有改变(图2)。相反，观察到的髓细胞比例的下降更可能是由T细胞绝对数量的增加引起的。结论是，当治疗引发目标子集分布的变化时，不一定是由于该细胞子集的绝对数量的变化，而可能是由于不同子集的扩张或收缩造成的。

图2:CT26肿瘤中T细胞和髓系细胞的分布与绝对计数测量。采用Student 's t检验进行统计学分析(*p<0.05)。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和T细胞亚群的下游免疫表型分析进一步强调了包括绝对计数终点的价值。如图3所示，虽然分析显示M2 TAMs在肿瘤中的比例下降，但绝对计数保持不变。因此，与最初的分析相比，绝对计数并不表明M2 TAM药效学有助于本研究的总体疗效。并且，这是一个基于现有数据的更可靠的结论。最后，抗mctla -4治疗引发了两种CD8的绝对数量的增加⁺T细胞和CD4⁺辅助T细胞。综上所述，这些数据证明了绝对计数对于准确量化组织来源亚群的总细胞数量是至关重要的。

图3:CT26肿瘤中M1和M2 TAMs、CD8+ T细胞和CD4+辅助细胞的分布与绝对计数测量。采用Student 's t检验进行统计学分析(*p<0.05)。

绝对计数方法

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和T细胞亚群的下游免疫表型分析进一步强调了包括绝对计数终点的价值。如图3所示，虽然分析显示M2 TAMs在肿瘤中的比例下降，但绝对计数保持不变。因此，与最初的分析相比，绝对计数并不表明M2 TAM药效学有助于本研究的总体疗效。并且，这是一个基于现有数据的更可靠的结论。最后，抗mctla -4治疗引发了两种CD8的绝对数量的增加⁺T细胞和CD4⁺辅助T细胞。综上所述，这些数据证明了绝对计数对于准确量化组织来源亚群的总细胞数量是至关重要的。

图4:使用绝对计数流面板测量吸入样品体积、总活细胞绝对计数和活CD45+细胞绝对计数的门控策略。

图4说明了如何计算绝对单元格计数。珠区量化流式细胞仪获得的珠的数量，以测量吸入的样品体积。细胞门是用活性染料分析的，它排除了死亡细胞。在排除死细胞后，测量CD45的表达，以计算落在活CD45中的细胞的百分比⁺电池门。CD45的总数⁺然后用下面的公式计算由细胞仪检测到的免疫细胞。最后，因为起始肿瘤质量是已知的，所以可以反向计算每克肿瘤的细胞数。

上述研究的完整数据集可按要求提供。它描述了检查点阻断对CT26肿瘤中以下亚群的计数和特征的影响;还有，用来做这些测量的流动面板。

• 粒细胞骨髓源性抑制细胞

• 单核细胞骨髓源性抑制细胞

• 树突细胞

• 肿瘤相关巨噬细胞(M1和M2)

• B细胞

• 自然杀伤细胞

• 自然杀手T细胞

• CD8+ T细胞

• CD4+辅助T细胞

• 调节性T细胞

请联系Labcorp的科学家，以获取完整的数据集或了解更多关于我们的绝对计数服务以及如何将其应用于临床前研究。金博宝188网址

参考文献

²Lewis, Katherine E.等，“白介素-21联合PD-1或CTLA-4阻断剂增强小鼠肿瘤模型的抗肿瘤免疫。”肿瘤免疫学7.1 (2018):e1377873。

^3.Muroyama, Yuki等，“立体定向放疗增加肿瘤微环境中功能抑制调节性T细胞。”癌症免疫学研究5.11(2017):992。

⁴Balza, Enrica等人:“TNF和melphalan的肿瘤递送诱导的治疗性T细胞反应依赖于自然杀伤细胞和树突状细胞的早期触发。”欧洲免疫学杂志47.4(2017):743-753。