流式细胞术测定临床前CA金博宝188网址R - t细胞持久性

在临床前研究和金博宝188网址开发过程中，CAR(嵌合抗原受体)t细胞疗法经常以小鼠为试验对象进行研究。在这种情况下，免疫功能低下的小鼠携带来自人类的肿瘤负担，并使用异基因的人类CAR - T细胞。过继转移的细胞由工程嵌合抗原受体引导与肿瘤细胞上的表面抗原(例如CD19)结合。

由于工程T细胞与肿瘤细胞结合，T细胞被激活并在MHC不受限制的庄园中杀死肿瘤细胞。在临床前研究研究金博宝188网址中的小鼠被跟踪一些预定义的参数，评估肿瘤生长和负担，以确定CAR - T细胞的功效(了解更多关于如何通过生物发光成像(BLI)确定疗效的信息．

CAR - T细胞抗肿瘤反应的一个关键成功因素是CAR - T细胞输注到宿主后存在多长时间(持久性)。尽管CAR - T细胞功能齐全，但已有研究表明，CAR - T细胞较差的持久性会限制有效的抗肿瘤反应。¹在临床环境中，恶性血液病患者的长期缓解与CAR - T细胞的持续存在有关。²共刺激信号被认为影响T细胞的扩张和持久性。金博宝188网址研究包括4-1BB共刺激结构域的CAR构建物的疗效的临床前研究与较长的CAR - T细胞持久性、较慢和持续的效应功能以及较高比例的记忆T细胞有关。^3.在临床前研究中评估CAR - T持续性对确定临床成功具有意义。金博宝188网址

本技术聚光灯将为读者提供有关在临床前阶段使用流式细胞术测量CAR - T细胞持久性的信息。金博宝188网址

CAR - T细胞候选评估的小鼠模型

2017年9月，美国食品和药物管理局批准了首个CAR - T细胞疗法。这种细胞疗法由诺华公司销售，名为Kymriah。Kymriah也被称为tisagenlecleucel并被批准用于对B细胞急性淋巴细胞白血病标准疗法不再有效的儿童和年轻人。Kymriah是基于卡尔·琼博士的工作。在NSG的宾夕法尼亚大学^TM老鼠。

的点头。Cg -Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ鼠标，通常以品牌名称NOD而闻名scidγ (NSG™)，不表达Prkdc基因和x连锁Il2rg基因。的scid(严重联合免疫缺陷)突变发生在DNA修复复合物蛋白Prkdc中，并导致小鼠B和T细胞缺陷。这些小鼠没有补体细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)，缺乏细胞因子信号通路。这些缺陷使小鼠对包括CAR - T细胞在内的人类免疫细胞的移植非常理想和高度适应。这些小鼠移植了广泛的人类肿瘤，是临床前CAR - T细胞研究的金标准。金博宝188网址

在我们的金博宝188网址临床前肿瘤科在美国，我们可以使用任何市售小鼠品系进行CAR - T细胞治疗和其他过继细胞转移研究，包括NSG^TM小鼠，在一定条件下，我们也可以接受特殊小鼠。

的PersistenceT^TM来自临床前肿瘤学的面板金博宝188网址用于生成纵向CAR - T细胞持久性数据，只需5 uL的全血即可使用。它被格式化为具有绝对计数的裂解/无洗试验。该小组具有灵活性，提供了在FITC, PE和APC渠道中添加特定抗car探针的机会。来自Jackson实验室(Bar Harbor, Maine, USA)的NSG小鼠给予2x10⁷在给药后7、14和21天抽取全血，并进行PersistenceT^TM小组评价。

表1描述了PersistenceT中使用的试剂^TM面板。门控策略详见图1。

表1:PersistenceT^TM抗体面板及其用途说明。

图1:使用PersistenceTTM面板分析人T细胞。门控策略从双排除开始(A)，然后移动到将珠粒荧光与珠粒计数门结合(B)。接下来排除碎片(C)，使用抗小鼠CD45和抗人CD45将小鼠细胞与人细胞区分开来(D)。通过抗人CD3门控分离人T细胞(E)，最后确定人CD8+和CD4+ T细胞的数量(F)。

利用PersistenceT对CAR - T细胞进行纵向免疫表型表征^TM面板

在临床肿瘤学背景CAR - T细胞的扩增和持久性与患者的反应和获得缓解相关。⁴由于这一观察结果，建立可靠的追踪CAR - T细胞数量的方法尤其重要，不仅在评估CAR - T细胞治疗的有效性方面，而且在临床前环境的安全性评估方面。金博宝188网址临床CAR - T细胞治疗的严重副作用被注意到，其中最严重的是细胞因子释放综合征(CRS)，与CAR - T细胞扩增有关在活的有机体内．⁵

的PersistenceT^TM面板直接适用于评估人类CAR - T细胞数量的样本从小鼠随着时间的推移。由于全血要求低，可以从同一只小鼠中多次提取样本，或通过使用小鼠队列来完成研究目标。NSG小鼠可进行长期研究，以集中评估CAR - T持续性。一个关于PersistenceT的例子^TM可用于测量NSG小鼠中人T细胞随时间变化的面板如图2所示。

提高CAR - T细胞的持久性

体内CAR - T细胞持久性是CAR - T细胞治疗长期临床疗效的替代标志。研究表明，含有CD28共刺激结构域的某些CAR - T细胞显示出T细胞衰竭相关基因的表达增加，而具有相同抗原特异性的4-1BB (TNFSF9)共刺激结构域减少了衰竭表型。这可能有助于解释为什么在复发或难治性急性淋巴细胞白血病患者的临床试验中，据报道表达CD28结构域的CAR - T细胞可以持续长达3个月，而表达4-1BB结构域的CAR - T细胞可以持续长达5年，并且在几乎所有可以评估的病例中超过6个月。⁶

CAR - T细胞代代相传

CAR - T细胞通过修饰嵌合抗原受体继续进化。每个CAR - T细胞都有一个单链片段变量。scFv是重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结构域的组合。单链抗体是免疫球蛋白VH和VL的融合蛋白，与10 - 25个氨基酸的短连接肽相连。

第一代CARs具有一个细胞外结合域、一个铰链区、一个跨膜域和一个或多个细胞内信号域。所有CAR - T细胞都有CD3 ζ链域用于细胞内信号传递，是T细胞激活信号的主要传递器。共刺激结构域(CD28或4-1BB)的加入定义了第二代CARs。目的是改善T细胞增殖，细胞因子分泌和体内持久性。

金博宝188网址临床前数据显示，与第二代CARs相比，第三代CARs具有更好的效应器功能和更长的体内持久性。第三代CARs具有多个共刺激结构域(CD28-41BB或CD28-OX40)。装甲车和卡车(CART细胞redirected为universalcytokinek是第四代CAR - T细胞有时使用的名称。第四代CAR - T细胞可以包括增强T细胞扩增、抗肿瘤活性和持久性的因素。⁷

不管CAR或TRUCK的生成，PersistenceT^TMPanel为临床前环境中CAR - T细胞体内持久性的短期或长期监测提供了极好的工具。金博宝188网址

总结

使用PersistenceTTM面板可以简单地测量CAR - T持久性。我们的流式细胞仪可以从少量血液中测定CAR - T的纵向持久性。我们的Human CompTTM面板(表2)是一个很好的例子，说明如何将其他合格的面板添加到临床前CAR - T研究中，以生成全面的流式细胞术数据集。金博宝188网址

表2。个体标记在人的CompT^TM白细胞面板。

要了解更多关于PersistenceT^TM面板，或我们的其他流式细胞仪面板之一，可以纳入您的临床前肿瘤研究，并了解更多关于我们广泛的流式细胞仪程序联系科学家。金博宝188网址

参考文献

¹Song DG, Ye Q, Carpenito C, Poussin M, Wang LP, Ji C, Figini M, June CH, Coukos G, Powell DJ Jr. car工程T细胞的体内持久性、肿瘤定位和抗肿瘤活性通过CD137 (4-1BB)的共刺激信号增强。

癌症决议2011年7月1日;71(13):4617-27。

²Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ，等。嵌合抗原受体T细胞用于白血病的持续缓解。中华实用医学杂志，2014;29(4):529 - 529。

^3.龙海楠，王晓明，陈晓明，等。4-1BB共刺激改善嵌合抗原受体紧张信号通路诱导的T细胞衰竭。医学杂志2015;21:581-90。

⁴波特DL，黄WT，弗雷NV，莱西SF，肖PA，罗伦AW，等。嵌合抗原受体T细胞持续存在并诱导复发难治性慢性淋巴细胞白血病的持续缓解。中国医学科学，2015;7(03):303ra139。

⁵桑托马索B，巴契尔C，威斯汀J，雷兹瓦尼K，夏波EJ。CAR - t细胞疗法的另一面:细胞因子释放综合征、神经毒性和经济负担。

Am Soc Clin Oncol教育书，2019年1月;39:433-444。

⁶小鼠MV和June CH.为过继t细胞治疗制造更好的嵌合抗原受体。临床癌症决议2016年4月15日;22日(8):1875 - 1884。

⁷Chmielewski M, Abken H. TRUCKs:第四代CARs。中国生物医学杂志，2015;15(8):1145-54。