使用细胞因子/细胞毒性™面板的流式细胞仪对肿瘤浸润淋巴细胞进行功能分析

促炎细胞因子反应结合颗粒酶B和CD107a (LAMP-1)的表达，是免疫肿瘤领域有价值的生物标志物^{1 - 3}．基于细胞的分析可以量化这些靶点在肿瘤源性效应淋巴细胞中的表达，为研究候选药物的作用机制提供了新的见解。临床前肿金博宝188网址瘤组提供了一种新的现成的检测方法，该方法利用细胞因子/细胞毒性标准流式细胞仪面板来量化T细胞、自然杀伤(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)亚群中的这些端点。本技术重点展示了细胞因子/细胞毒性™面板如何被纳入在活的有机体内研究和与传统免疫表型相结合，有助于在临床前药物开发期间建立健壮的数据集。金博宝188网址

细胞因子包括IFNγ、TNFα和IL-2在肿瘤微环境中通过促进先天和适应性免疫细胞激活和T细胞增殖具有抗肿瘤活性。在活的有机体内通过T细胞激活来抑制肿瘤生长的疗法，通过直接或间接的机制，通常会增加肿瘤浸润T细胞的频率，而这些T细胞会对肿瘤产生强烈反应体外刺激。在启动和随后IFNγ/TNFα的产生方面，NK和NKT细胞中已经证实了类似的作用。除了细胞因子的产生，在活的有机体内治疗可诱导效应淋巴细胞获得增强的细胞毒性，使肿瘤细胞通过直接细胞间接触机制裂解。这一过程是由储存在免疫细胞内的细胞溶解颗粒中穿孔素和颗粒酶的表达和释放介导的。这些毒素破坏细胞膜，诱导靶肿瘤细胞凋亡。此外，脱颗粒与效应细胞表面CD107a的表达一致，因此可以作为细胞毒活性的标记。

综上所述，上述特征可以用来检测肿瘤微环境中淋巴细胞亚群的激活状态。细胞因子/细胞毒性面板通过结合使用T细胞、NK和NKT细胞特异性抗体的细胞表面免疫表型和细胞内细胞因子和颗粒酶B表达染色来实现这些测量(表1)。

表1:细胞因子/细胞毒性™面板

放疗和抗mctla -4治疗后4T1-luc肿瘤源性效应细胞细胞因子和颗粒酶B的分析

在使用小鼠4T1-luc乳腺癌模型的数据集中，细胞因子/细胞毒性面板用于测量细胞因子和颗粒酶B的效用得到了证明。图1显示了用于划分T细胞和NK细胞子集的门控策略。与我们所有的临床前肿瘤流式细胞仪面板一金博宝188网址样，分析从死亡细胞的排除开始，然后描述CD45⁺免疫细胞识别感兴趣的免疫亚群(未显示)。PMA/离子型霉素刺激后IFNγ、TNFα、IL-2和颗粒酶B的代表性表达谱显示。

4T1-luc肿瘤微环境具有高度免疫抑制作用，其特征是存在大量粒细胞骨髓来源的抑制细胞浸润(未显示)。4T1-luc是一种已知对检查点抑制疗法有耐药性的模型。然而，当与小动物辐射研究平台(SARRP, Xstrahl)提供的辐射结合时，anti-mCTLA-4可以改善4T1-luc肿瘤的生长抑制(图2A，左)。肿瘤生长抑制可能不是由于治疗诱导的效应细胞募集的增加，因为流式细胞术没有显示出肿瘤中T细胞或NK细胞计数的增加在活的有机体内与同型对照组相比(图2A，右)。然而,体外PMA/ iononomycin对肿瘤源性细胞的刺激显示CD8⁺T细胞产生IFNγ的能力增强。此外，与对照组相比，NK细胞表达了更高水平的颗粒酶B(图2B)。这些数据表明，放疗和抗mctla -4联合治疗可增强CD8的激活状态⁺T细胞和NK细胞。这证明了在疗效和免疫表型研究中纳入机制标记的价值。

图2:4T1-luc模型效应细胞促炎反应分析。建立4T1-luc肿瘤的BALB/c小鼠(n=6/组)给予抗mctla -4(克隆9D9)，局灶辐射(RAD);SARRP, Xstrahl Inc.)是这两种抗体的组合，或同型对照抗体。在数据采集前，将肿瘤分离成单细胞悬液(绅士macs™，Miltenyi Biotec)，并用荧光抗体标记。为了进行细胞因子和颗粒酶B分析，在brefeldin a的存在下，用PMA/离子化霉素体外刺激肿瘤来源的细胞5小时。孵育后，收集细胞并对细胞内靶点进行免疫染色。数据采集在Attune™NxT (ThermoFisher Scientific)流式细胞仪上，然后使用Flowjo软件(BD)进行分析。

抗mctla -4治疗后CT26肿瘤源性效应细胞脱颗粒分析

CD107a在脱颗粒过程中在细胞表面表达，是一种常用的标记物，用于测量治疗对细胞毒性活性的影响。细胞因子/细胞毒性™面板用于检测抗mctla -4对小鼠CT26结直肠癌模型中淋巴细胞细胞毒性和肿瘤生长的影响。使用抗mctla -4治疗的CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制率为74%(图3A)。为了检验细胞毒性，检测CD8中CD107a和颗粒酶B的表达⁺T细胞，NK细胞，NKT细胞体外PMA/ iononomycin对肿瘤来源细胞的刺激。代表性的表达谱如图3B所示。分析显示，与同型对照处理的动物相比，抗mctla -4处理引发了所有三个亚群CD107a表达的增加。这与NK和NKT细胞颗粒酶B表达水平的降低相一致。这些数据表明，NK和NKT细胞中储存的颗粒酶B在脱颗粒过程中被耗尽。请注意,CD8⁺T细胞颗粒酶B的表达在两组间无差异，可能是由于平衡新创颗粒酶B的表达及脱粒率。总的来说，这种表型与治疗诱导的细胞毒性增强和直接杀伤肿瘤细胞活性的潜力相一致。

图3:CT26模型的细胞毒性分析。建立CT26肿瘤的BALB/c小鼠(n=10/组)给予抗mpd -1(克隆RMP1-14)或同型对照抗体。体外刺激和免疫表型进行如上所述。

定制-面板配置定制细胞因子反应

细胞因子/细胞毒性™面板预先配置用于测量促炎细胞因子。该面板还可以定制，以检查其他细胞因子的反应。例如，辅助性CD4⁺T细胞分化成不同的CD4细胞⁺效应表型，包括Th1, Th2和Th17。这些亚群在肿瘤发病机制中具有不同的作用。Th1细胞的特征是释放IFNγ，而Th2和Th17细胞的特征是分别产生IL-4和IL-17。细胞因子/细胞毒性™面板可以定制，包括IL-4和IL-17A，以促进对肿瘤微环境中辅助性T细胞分化的治疗诱导效应的机制分析。

要了解更多关于细胞因子/细胞毒性™面板如何被纳入您的临床前肿瘤研究，请联系Labcorp的科学家。金博宝188网址

参考文献