在发现环境中测量小鼠样本中的人类细胞因子:了解免疫分析技术并管理风险

简介

小鼠模型通常用于各种与癌症相关的研究，其中它们承载人类细胞(1)。虽然(免疫缺陷)小鼠模型确实有其优点和缺点，但在临床前肿瘤学中，小鼠仍然是常用的测试系统。金博宝188网址

在蛋白质水平上，人类和小鼠的氨基酸序列相似，有时甚至几乎相同(表1)。当人类肿瘤细胞和人类淋巴样细胞在免疫缺陷小鼠中用于免疫肿瘤或嵌合抗原受体T (CAR - T)细胞研究时，可以使用一系列方法来评估其功能和肿瘤消退。在这里，我们讨论与免疫测定相关的技术方面，当考虑测量从老鼠样本中提取的人类蛋白质。在解释这种不寻常情况下的数据时，理解免疫分析技术是必不可少的。

ELISA

在临床前阶段，金博宝188网址大多数实验室从可信的商业供应商购买免疫分析方法，以量化血清或血浆中感兴趣的蛋白质水平。合同研究组织(crs)在使用商业来源的免疫测定法方面有丰富的经验，可以帮助决策过程中选择最合适的方法和从哪家公司购买。这些商业来源的方法通常是夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒。在药物开发的临金博宝188网址床前发现阶段，不需要对免疫分析方法进行良好实验室规范(GLP)验证，但肯定需要质量数据。为了支持候选药物的安全性评估，免疫分析的GLP验证将在药物发现和开发过程的后面进行。

ELISA方法是将抗体被动吸附在塑料表面(通常是96孔板)上，以捕获目标蛋白。用缓冲液洗涤后，加入样品。在短暂的潜伏期后，样本被洗掉，并添加另一种抗体(“检测”抗体)。检测抗体与捕获的目标蛋白结合，形成“三明治”(图1)。检测抗体通常用改变底物颜色的酶标记，或用发光的分子标记。信号(光密度或光能)与样品中的蛋白质浓度成正比。更多关于免疫分析技术的细节可以在许多评论中找到(2-4)。

MSD平台

Meso Scale Discovery (MSD)平台是一个多功能的免疫分析平台。目前市面上MSD的检测方法是通过电化学发光(ECL)发射光能的夹心免疫检测(ELISA)。MSD提供数以百计的免疫检测试剂盒，包括人类、小鼠和大鼠蛋白质的无数多路复用选择，这些蛋白质通常被CROs、制药和生物技术公司以及一些学术机构所使用。MSD是免疫原性测定(也称为抗药物抗体[ADA]测定)的首选平台，通常用于定制的药代动力学(PK)测定生物药物的浓度。在MSD平台上构建的ADA和PK分析通常通过GLP验证的严格要求。

MSD平台允许“多路复用”。多路复用是一种可以在单井中对多种分析物进行定量分析的技术。多路复用节省了时间，减少了需要处理的板的数量，并节省了样品数量，因为相同的50微升样品可以被分析多达10种不同的方法。在评估毒性、确定作用机制(MOA)或生物标志物发现测定时，复用是非常宝贵的(5)。

矩阵

添加到ELISA板孔中的生物液体是基质。基质通常是血清或血浆，但也可以是组织培养基、玻璃体(来自眼睛内部的液体)、滑膜液(关节)、尿液、眼泪、汗水，甚至是用于释放细胞内蛋白质的细胞裂解缓冲液。基质是一种复杂的液体，会在ELISA检测中引起许多问题。这些问题统称为“矩阵效应”。基质效应是由内源性成分干扰引起的，包括白蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、补体C4、载脂蛋白和触珠蛋白，这些内源性成分在物种之间的丰度和氨基酸序列不同。基质效应通常通过稀释、稀释线性或峰值和回收实验进行研究(6)。生产商通常会声称他们的免疫分析法适用于血清和/或血浆，但并不适用于所有可能的基质。市面上可用的免疫测定法很少对人和小鼠的血清和血浆进行验证。将免疫分析法用于非生产厂家预期的用途是可识别的风险。一些制造商在他们的文献中发表免责声明，声明不支持使用他们验证过的矩阵以外的矩阵。了解风险是很重要的，特别是当使用商业分析法从小鼠基质中定量检测人类蛋白质时。

免疫原

免疫分析使用抗体作为工具来捕获和检测感兴趣的蛋白质(图1)。免疫原被注射到动物体内以引起免疫反应。从注射了免疫原的动物中提取的抗体被用作免疫分析的关键材料。在生成抗体试剂用于蛋白质靶点的免疫分析开发的情况下，蛋白质就是免疫原。可以使用各种大小和来源的蛋白质免疫原。常用的是重组蛋白，较少使用纯化的内源性蛋白。实验室合成的小肽(8-20个氨基酸)或稍大的肽(20-100个氨基酸)通常被使用，因为肽的合成很容易，而且已知的氨基酸序列相对较短，与全长蛋白质相比。由于物种间具有潜在的同源性，免疫原的氨基酸序列是非常重要的信息。在表2中可以找到许多基于web的资源，其中包含关于小鼠和人类蛋白质的氨基酸序列信息。获取用于在商业购买的ELISA检测中发现的抗体产物的免疫原的信息可能是困难的。抗体和ELISA试剂盒供应商经常声称，用于免疫动物的氨基酸序列的特定信息是“商业秘密”或“机密”。 A common entity in the antibody and ELISA kit business is the ‘OEM’ (Original Equipment Manufacturer) that many people associate with the automotive parts business. Many, but not all, companies that sell ELISA kits or antibodies do not actually make the kit or antibody themselves (7). They purchase the antibody or ELISA from someone else and then market it under their own branding. This creates issues for the consumer, including the availability of technical support assistance, information on timelines regarding when the product will ship, and price.

交叉反应性

在免疫分析中用作捕获或检测试剂的抗体通常只与一种蛋白质结合，即感兴趣的分析物。有时，免疫分析法可以检测到一种以上的蛋白质。这被称为交叉反应。在小鼠基质中测量人类细胞因子的情况是非常不寻常的。物种交叉反应是一种免疫分析法可以从两个或两个以上物种中检测出蛋白质的同源物。仔细考虑分析物的氨基酸序列在人与小鼠之间的同源性，需要管理物种交叉反应的潜力。用于产生捕获和检测抗体的免疫原的氨基酸序列是极其重要的信息;当使用商业购买的检测方法时，供应商通常不会透露这些信息。

物种交叉反应性测试

为了评估在人体多重组合中的单个检测将检测小鼠细胞因子的可能性，我们在体外生成了含有高水平小鼠细胞因子的IFNℽ、IL-10、IL-2、IL-6和TNF-α的样本，并将样本应用于人体多重组合。低温保存的小鼠脾细胞解冻为完全培养基(RPMI 1640, 10%胎牛血清，1X谷氨酰胺，10mm HEPES, 1mm丙酮酸钠，1X非必需氨基酸)。活细胞计数采用CytoFLEX LS流式细胞仪绝对计数。细胞以1x10的密度播种到6孔板中⁶细胞/mL，体积为10 mL/孔。在37℃，5% CO中孵育₂加湿培养箱5小时。脾细胞用50 ng/mL PMA和500 ng/mL离子霉素刺激过夜。来自同一脾脏的未受刺激的细胞被平行培养作为阴性对照。隔夜培养结束后，收集培养基，离心(300rcf)取细胞8分钟，上清冻存-80℃保存。小鼠脾细胞分泌的细胞因子在V-PLEX促炎组1小鼠(目录号K15048D-1)中进行分析，结果如表3所示。小鼠脾细胞分泌的细胞因子随后在V-PLEX促炎组1 Human(目录编号K15049D-1)中进行分析，结果如表4所示。对于可评估的细胞因子(IFNℽ，IL-10, IL-2, IL-6和TNF-α)，没有观察到物种交叉反应。

总结

从生物分析的角度来看，从老鼠样本中测量人类细胞因子是一种不寻常的情况。理解潜在干扰的技术方面是很重要的，当解释免疫分析法产生的数据用于制造商意图范围之外的目的时。在MSD V-PLEX促炎组中，对于可评估的细胞因子(IFNℽ，IL-10, IL-2, IL-6和TNF-α)，物种交叉反应性似乎不是问题。经过对现有信息的仔细评估，该化验方法似乎适合使用。关于评估人类免疫细胞宿主小鼠的人类细胞因子水平的更详细讨论，请使用下面的链接与我们联系。

联系临床前肿瘤科学团队了金博宝188网址解更多。

图1。夹心ELISA。小鼠单克隆抗体(蓝色)被动结合到96孔板的孔上，捕获蛋白质分析物(靶蛋白)。一个磺基标签(黄星)标记的兔多克隆抗体(红色)结合捕获的分析物，形成一个“三明治”。硫标签与衬底的相互作用产生的光可由MSD仪器内的摄像机测量。产生的光量与捕获的分析物量成正比。

表2。选择基于网络的蛋白质和氨基酸序列信息资源(8)。

表3。用PMA (phorbol 12-肉豆蔻酸13醋酸酯)和电离霉素处理培养的小鼠脾细胞，分析细胞培养基中小鼠细胞因子在MSD V-PLEX促炎Panel 1 Mouse Kit中的含量。以pg/mL报告的值。

*BLD:低于检测极限

参考文献

1.Bult CJ, Krupke DM, Begley DA，等。小鼠肿瘤生物学(MTB):人类癌症小鼠模型的数据库。核酸Res. 2015 Jan;43(数据库发布):D818-24。

2.酶的免疫测定-概述。临床生物化学。1983;16(1):4-9。

3.ELISA的简要历史、原理和类型，以及我们实验室使用ELISA进行肽/蛋白质分析的经验。肽。2015;72:4-15。

4.Porstmann T和ST kising。酶免疫分析技术。概述。中华免疫学杂志1992;150(1-2):5-21。

5.Jani D, Allinson J, Berisha F，等。药物开发中生物标志物多重配体结合试验的使用和适合目的验证的建议。中国生物医学工程学报2016;18(1):1 - 14。

6.涂杰，班尼特。平行实验评价基质效应，配体结合分析方法发展的选择性和敏感性:优点和缺点。生物分析法。2017;9(14):1107 - 22所示。

7.卡梅隆乔丹。抗体供应商的商业行为如何影响你的配体结合试验。生物分析法。2014;6(12):1585 - 9。

8.Cowan KJ, Amaravadi L, Cameron MJ，等。蛋白质生物标记物测定校准器材料的选择和表征建议。中国生物医学工程学报2017;19(6):1550-63。