FDA和ema推荐的研究
细胞毒性和稳定性测定
CYP mRNA和酶诱导
在研究药物的代谢质量的同时，你还需要包括酶诱导研究，以强调当你的药物诱导或增强酶表达时，达到伴随给药的有效血浆浓度的潜在问题。酶诱导可导致增加代谢清除或毒性，这是由增加全身暴露的活性代谢物。
在人肝细胞单层培养中暴露于试验品后，体外测量cypp酶(典型的CYP1A2, CYP2B6和CYP3A4)的诱导。
初步实验应研究其诱导CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶的潜力。如果观察到CYP3A4酶的诱导，发起者还应评估CYP2C酶(CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19)的诱导潜力。然后将其效果与被研究的CYP酶的阳性对照诱导剂所诱导的效果进行比较。此外，离体动物肝脏(通常是小鼠、大鼠、狗或猴子)可加工成亚细胞组分，并用于评估试验品介导的药物代谢酶在体内给药期间的影响安全评估研究。
FDA和EMA药物-药物相互作用(DDI)指南都推荐这些研究，以评估细胞色素P450对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A4的诱导作用first-in-human试验．
诱导数据用于确定临床DDI研究的要求和范围。
在初步试验中，来自一个供体的肝细胞被培养在有测试物(五种浓度)或阳性对照他莫西芬(50 μ M)的三重复孔中，在37°C和5% CO2的潮湿培养箱中培养72小时，每24小时交换一次培养基±测试物或对照物。72小时后，肝细胞的活力将使用MTS试验进行评估。结果将用于确定诱导试验的无毒试验品浓度。
与细胞毒性试验相结合，收集培养基样品，以评估试验物品随时间的浓度。
来自三个供体的肝细胞在有或无试验物(七种浓度)或对照诱导剂(见下文)的条件下，在三重复孔中，在37°C、5% CO2的潮湿培养箱中培养72小时，每24小时交换一次培养基±试验物或对照物。72h后提取mRNA，实时荧光定量PCR检测基因表达。每个CYP mRNA的水平归一化为内源性控制基因(如GAPDH)的水平。然后用2-ΔΔCT方法计算CYP基因表达的折叠诱导。试验物品依赖的CYP mRNA水平的增加，相对于车辆对照≥2倍，或应答≥阳性对照应答的20%，可能被解释为阳性结果。
来自三个供体的肝细胞在有或无试验物(三种浓度)或对照诱导物(如上所述)的条件下，在三重复孔中，在37°C、5% CO2的潮湿培养箱中培养72小时，每24小时更换一次培养基±试验物或对照物。72小时后，肝细胞在含有适当的CYP底物的新鲜培养基中孵育2小时(见下文)，之后终止反应，收集样品用于使用液相色谱-质谱(LC-MS)分析方法分析代谢物(见下文)。试验物品依赖性的CYP酶活性增加，相对于对照≥2倍，或应答≥阳性对照应答的20%，可能被解释为阳性结果。
酶活性测定 |
||||
|---|---|---|---|---|
CYP酶 |
诱导物 |
Non-inducer |
底物 |
被分析物 |
CYP1A2 |
奥美拉唑 |
Flumazenil |
非那西汀 |
对乙酰氨基酚 |
CYP2B6 |
苯巴比妥 |
Flumazenil |
安非他酮 |
Hydroxybupropion |
CYP3A4/5 |
利福平 |
Flumazenil |
咪达唑仑 |
1 ' -Hydroxymidazolam |
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