内分泌干扰物筛选计划-鱼类短期繁殖试验

作者:

Sarah Broadley，理学学士(荣誉)，理学硕士，PGCE，专业病理服务研究科学家;Catherine Ross博士，DVM，理学硕士，MRCVS，病理学家，病理学科万斯实验室有限公司，哈罗盖特，英国

日期:

2021年1月

简介

“内分泌干扰物是一种外源性物质或混合物，它改变了内分泌系统的功能，从而对完整的有机体、其后代或(亚)种群造成不利的健康影响。”WHO-ICPS, 2002年。

内分泌干扰物筛查计划(EDSP)旨在确定一种农药、化学品或其他物质是否会因干扰内分泌系统而对人类健康或环境构成风险。短期繁殖试验(试验指南229)使用黑头鲦鱼(Pimephales promelas)和日本medaka和斑马鱼的一个端点子集进行验证。该试验将生殖适合度作为毒性作用的综合衡量标准，采用了一套组织学和生化终点，反映了与下丘脑-垂体-性腺(HPG)内分泌轴紊乱相关的影响。

规定

2018年，经合组织发布了经修订的《内分泌干扰化学品测试和评估概念框架》。概念框架由五个级别的测试组成，旨在作为工具箱使用。

第一级根据现有信息进行排序和优先级排序。

第2级:提供机理数据的体外试验。

第3级体内分析提供了选定的内分泌机制和影响的数据。

第4级体内试验提供有关内分泌机制不良影响的数据。

第5级体内试验提供了关于内分泌和其他机制影响的全面数据。

鱼类短期繁殖试验与两栖动物变形试验、子宫营养试验和赫什伯格试验一起属于第3级。

目前，在欧盟，没有法律要求使用特定的测试来检测内分泌紊乱，除非有要求。

然而，在美国，检测是强制性的，美国环保局已经制定了两层策略。

第1层化验-体外和体内试验的选择。鱼类短期繁殖试验和两栖动物变形试验属于这一范围的试验。

第2层化验-体内根尖分析包括哺乳动物2代毒性、两栖动物生长/繁殖、鸟类2代、鱼类2代和Mysid 2代。

鱼类短期繁殖试验

材料与方法

该测试需要三种测试浓度和对照。

斑马鱼每次处理2个容器(每个容器包含5只雄性和5只雌性)。

每次处理四艘船(每艘船载有2只公鱼和4只母鱼，因为公鱼的领地行为)。

每个处理使用四个容器或重复(每个容器包含3个雄性和3个雌性)。

评估下列参数:

〇分析化学每周从水箱中采集水样，分析测试化学水平。

卵黄蛋白(Vg) -用ELISA法测定蛋黄前体蛋白的含量。Vg通常只在雌性鱼中表达，在雄性鱼中休眠。然而，当雄性鱼暴露于内分泌干扰物时，Vg基因以剂量依赖性的方式表达。因此，Vg基因在雄性鱼体内的表达被用作暴露于雌激素内分泌干扰物的标记物。

形态观察-第二性征的出现和观察包括;男性的颜色和脂肪垫(终止时的存在和体重)，婚礼结节测绘，每日生存评估和行为与对照组相比。

评估受精成功，目测胚胎，计数不育和可育卵子。

繁殖能力,对每天的产蛋量进行评估。

生存，行为和外表-与对照组相比，每天观察鱼的死亡率和异常行为

第二性征的观察次生特化的性别特征也被观察到，如雄性黑头米诺鱼的婚结节和日本美达卡鱼的乳头状突起。

图1。图为雄黑头鲦鱼的婚礼结节。使用定位模板记录结节的数量和大小，并按以下顺序排列:0 -缺失，1 -存在，2 -扩大，3 -明显。

图片摘自OECD(2012)，测试No. 229:鱼类短期繁殖试验，OECD化学品测试指南，第2部分，OECD出版社，巴黎。https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

组织学制备

组织调整/处理

愚蠢的小鱼鱼——鱼的性腺被解剖，整个加工成石蜡。

日本斑鱼和斑马鱼如果需要，鱼的胴体被修剪，躯干被整个加工成石蜡。

嵌入,性腺/鱼是水平朝向它们的长轴。

切片法,通过性腺的中心取三步切片并用苏木精和伊红染色。

组织病理学

男性-主要诊断标准包括:精子原原症比例增加，存在睾丸-卵子

睾丸退化加重

间质(Leydig)细胞增生/肥大

男性-次要诊断标准包括:

精原细胞比例降低

血管或间质蛋白液增加，性腺发育不同步

精子细胞或精子细胞比例改变性腺分期

肉芽肿性炎症

图1。雄性黑头鲦鱼的性腺，放大20倍。Bar = 50 μ m。

图2。雄性黑头鲦鱼的性腺，x40倍放大。Bar = 20 μ m。注意精子发育的各个阶段都围绕着小叶排列:(1)1˚精原;(2) 2˚精原细胞;(3) 1˚精母细胞;(4) 2˚精子细胞;(5)精子。

组织病理学

女性-主要诊断标准包括:

卵母细胞闭锁增加

卵泡周细胞增生/肥大卵黄形成减少

性腺分期的变化

女性-二级诊断标准包括:

间质纤维化

肉芽肿性炎症排卵后卵泡减少

图3。雌性黑头鲦鱼的性腺，x4倍放大。Bar = 200µm。注意两张图中卵母细胞发育的阶段:(1)核周卵母细胞;(2)皮层肺泡卵母细胞;(3)早期卵黄卵细胞;(4)晚期卵黄卵细胞。

图4。雌性黑头鲦鱼的性腺，x40倍放大。Bar = 20 μ m。